一、引言
如今，每八名女性中就有一人被诊断为乳腺癌，使其成为女性中最常被诊断出的恶性肿瘤。乳腺癌也是美国女性癌症相关死亡的第二大原因；然而，当乳腺癌在早期被诊断时，局限性乳腺癌患者的生存率可达98%。治疗依赖于手术以完成患者的全程管理。在接受手术治疗的患者中，75%适合接受乳腺保乳治疗（BCT），也称为部分乳腺切除或肿物切除。在该手术中，肿瘤首先通过新辅助治疗缩小，然后局部切除，以尽量减少对患者的美容和心理影响。该手术比全乳切除创伤更小，且已被证明可提供相似的长期生存率。
复发与所有残余肿瘤细胞的完全清除直接相关。因此，临床对成功部分切除的标准通常是在切除组织中获得肿瘤周围1–2 mm的阴性（无瘤）切缘。因此，切缘在患者乳腺癌局部复发的预后中起关键作用，并与BCT作为治疗方式的成功直接相关。这进而引出了对术中实时评估切除前沿的关键需求，以便可立即对可疑切缘进行再次切除，最大限度减少二次手术的必要性。
任何用于评估手术切缘的方法必须快速且相对简单，才能用于常规临床护理。最简单的确定切缘状态的技术是肉眼观察切除组织是否有肿瘤证据，该方法导致误诊，从而至少25%的病例需再次手术或面临更高复发风险。标准组织病理学连续切片可提供切缘状态的最终诊断，但结果可能需数日至一周以上。这一延迟使患者处于不确定和等待状态，若发现切缘阳性，则可能需再次手术（20–70%的病例）。因此，当前方法的局限性强调了对实时、术中、准确评估乳腺手术切缘工具的需求。
展开剩余89%在本文中，我们介绍了空间偏移拉曼光谱（SORS）的开发，用于在100–2000 μm空间尺度下对手术切缘进行次表层评估。该项目的科学目标是评估SORS在所需空间尺度下对细微差异组织进行生化分离的能力，从而进行切缘评估。该研究的临床目标是开发一种方法，以在手术室实时检测临床接受的1–2 mm切缘区域内是否存在肿瘤细胞，从而为外科医生提供实时反馈，并可在同一手术程序中切除额外组织以实现阴性切缘，消除二次手术的需要。
二、光学方法与切缘分析
2.1 拉曼光谱原理
拉曼光谱基于涉及振动能级跃迁的非弹性散射。因此，拉曼光谱由一系列峰组成，代表散射分子的不同振动模式。这些峰光谱窄且分子特异，使得观察到的峰可与特定分子中的特定键关联。许多生物分子具有独特的拉曼光谱，可用于确定组织的生化组成。癌细胞中一个特别相关的生化变化是核酸含量的增加，这可能与增殖增加和遗传不稳定性相关。这一变化以及其他变化（如糖原和胶原的变化）可通过拉曼光谱检测并用于癌症检测。
研究人员已在宫颈、膀胱、前列腺、肺、皮肤及胃肠道等多个器官中利用此类癌症特异性拉曼特征。若干研究团队已针对拉曼光谱在乳腺癌诊断中的应用开展工作。科学家首次利用拉曼光谱区分正常与恶性乳腺组织。随后，科学家进行了大量工作，利用拉曼光谱进行乳腺癌诊断，能够以94%的敏感性和96%的特异性区分恶性与正常及良性组织。值得注意的是，上述所有工作均聚焦于乳腺癌诊断，而非治疗指导或切缘评估。
除拉曼光谱外，亦有射频光谱、弹性散射光谱、光学相干断层扫描（OCT）及漫反射光谱等新型切缘评估方法的报道；然而，大多数这些方法存在敏感性或特异性不足的问题。OCT可提供高分辨率图像，可用于切缘分析指导。最近，科学家表明OCT在判断肿瘤切缘阳性方面的总体准确率为75%。科学家报道使用漫反射光谱进行切缘评估，总体准确率亦为75%。这些研究相较于当前临床术中检测标准有所改善，但其对患者护理的影响仍有限。
科学家发表了唯一一项使用拉曼光谱进行乳腺切缘分析的研究，其中正常、纤维囊性及恶性组织的分类总体准确率为93%。然而，该研究依赖于标准光纤探头配置，仅采集前几百微米深度的信号，未考虑将阴性切缘判断深度设定为1–2 mm的需求。尽管拉曼光谱可为乳腺肿瘤切缘提供特异性生化信息，理想的光学系统应能在至少2 mm深度内以秒至分钟级速度在手术室解析这些信息。
三、空间偏移拉曼光谱（SORS）
光学技术依赖于光的穿透以获得与深度相关的信息，这进而取决于所用光的波长。在光源与检测元件之间引入空间偏移可为光谱测量提供所需的深度选择性。图1展示了提供深度分辨的光子路径。较大的源-检测间距更易检测到多次散射、穿透更深的光子；较小间距则检测到仅经历少量散射、停留在浅层的光子。科学家首次通过双层仿体展示该效应，每层具有不同化学特征的光谱。随着源-检测偏移增大，测得光谱逐渐接近底层纯光谱。同一团队首次将该技术用于生物学，透过数毫米软组织检测到骨骼的强拉曼信号。然而，早期SORS仅限于检测小面积强散射体，如软组织下的骨骼。本文结果展示了SORS在软组织多层结构中的应用，特别是用于在次毫米尺度下透过正常组织下层检测癌症。
图1. 示意图显示肿瘤阳性与阴性切缘，定义为手术切缘与肿瘤边界的距离。叠加可能的光子迁移路径，展示SORS在本应用中的优势。
SORS的基本原理因此可用于从多达临床相关的1–2 mm深度获取切除部分乳腺标本的测量。为展示对深层细微差异软组织的检测，将一层正常人乳腺组织置于两片100 μm石英盖玻片之间。正常层厚度0.5–2 mm，直接置于厚度2–5 mm的乳腺癌组织样本上方。使用一根激发光纤（S）递送激光，一根检测光纤（D）收集拉曼信号，测量时改变S-D间距从0.75至4.75 mm，步长0.5 mm。图2显示1 mm正常层厚度实验设置下获得的光谱，以及正常与肿瘤层的平均光谱（直接测量）。随着空间偏移增大，光谱逐渐更接近肿瘤光谱而非正常光谱。
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图2. 1 mm正常层实验的拉曼光谱，灰框标示随S-D偏移增大（左侧标注）从正常向肿瘤特征变化最显著的区域。
图2中浅灰框标示随空间偏移增大观察到的最显著光谱变化区域。图3给出这些区域的放大图，包括归因于苯丙氨酸的1006 cm⁻¹峰增强、1303/1265 cm⁻¹峰比值增大（提示蛋白含量增加）、1656 cm⁻¹附近酰胺I峰变宽。其他显著变化包括1445 cm⁻¹ CH₂变形峰相对强度下降、1748 cm⁻¹羰基伸缩峰下降、1156 cm⁻¹类胡萝卜素峰上升。这些结果表明SORS可用于检测正常乳腺组织下的乳腺肿瘤光谱贡献。
图3. 为便于观察相关但细微的光谱变化，给出1006 cm⁻¹苯丙氨酸峰、1265 cm⁻¹酰胺III与1303 cm⁻¹脂质峰、1440 cm⁻¹ CH₂弯曲/变形峰及1656 cm⁻¹酰胺I峰肩部的放大图。
为将研究可行性转化为临床适用设置，设计了一种基于光纤的探头，以获得2 mm采样深度，使探头对该深度内肿瘤细胞的存在敏感。此外，固定源-检测偏移，仅采集组织表层2 mm的拉曼信号。基于实验及计算机模拟结果，确定最大源-检测偏移3.5 mm可提供在高达2 mm深度的正常乳腺组织下检测乳腺肿瘤所需的收集几何。若使用更大偏移，则可检测超过2 mm深度的肿瘤。
构建了一种多偏移SORS探头（由EMVision组装），包括一根400 μm直径源光纤，及四组（部分）300 μm直径收集光纤环（编号R1–R4）。内置滤波片用于拒绝光纤内产生的弹性散射光。与典型临床拉曼设置一样，源探头由785 nm二极管激光器（Innovative Photonic Solutions）提供80 mW功率。检测光纤将光送至近红外优化光谱仪，色散后由深耗尽热电制冷CCD记录。入口狭缝70 μm，系统在900–1800 cm⁻¹区域的光谱分辨率约11 cm⁻¹。光谱经仪器响应校准、噪声及荧光背景处理。
四、乳腺肿瘤标本的SORS检测
经范德堡大学机构审查委员会及美国陆军医学研究与发展部人体研究保护办公室批准，从接受部分或全乳切除的女性获得35例人乳腺组织标本。其中15例切缘>2 mm无瘤；其余20例为阳性切缘，定义为良性组织厚度<2 mm。为从阳性切缘标本获取拉曼光谱，将SORS探头置于肿瘤上方外观正常区域，以模拟标准临床切缘评估流程。光谱采集10–30 s并处理。为与组织病理学切缘评估对照，测量点用墨水标记、固定并连续切片。
图4展示两种切缘情形及其所得光谱。“S”箭头标示激发光纤位置，R1–R4为检测光纤环位置。图4a插入图所示组织切面的光谱。此例中，源光纤照射大片脂肪区（H&E染色下呈白色），最外收集光纤（R4）采集穿过大片肿瘤区（深粉色）的光子。尽管光谱变化细微，靠近肿瘤的环采集到的光谱更接近纯肿瘤光谱，提示每环采集到不同体积信息。这些变化随源-检测偏移增大而出现，与图2所示相似。
图4. (a) 插入图组织各检测环SORS光谱，右侧大片正常脂肪（N）与左侧实体肿瘤（T）。(b) 表面少量正常脂肪夹杂深染肿瘤组织的切缘情形光谱。箭头再次标示光纤位置。
图4b展示正常与肿瘤无明显分界的情形。探头源光纤置于表面狭窄良性区，检测光纤多位于肿瘤区。因此，该标本光谱既包含最小源-检测偏移光纤的正常脂肪乳腺组织特征，也包含大偏移光纤的纯肿瘤特征。由此可见，不同检测环按预期采样多个体积，且SORS探头可采集不同深度生化差异数据。
临床上，仅需判断给定测量在探头2 mm深度内是否存在肿瘤细胞。为实现这一临床相关方案，将所有环的光谱平均，每测量点生成一条光谱。采用稀疏多项逻辑回归（SMLR）贝叶斯机器学习框架，根据训练集计算光谱属于某组织类别的后验概率。二分类分析（阳性或阴性切缘）中，概率高者即为光谱分类结果。表I给出使用SMLR对这些复合光谱的分类混淆矩阵。结果显示，SORS评估乳腺肿瘤切缘的敏感性为95%，特异性为100%。
表I：体外标本“切缘分析”混淆矩阵
基于体外研究的有希望结果，招募乳腺肿瘤患者进入试点临床研究，同样经范德堡IRB批准，以确定SORS是否可在手术室对离体标本进行阳性及阴性切缘检测。为使用当前单次测量3.5 mm区域的SORS探头标准化研究方案，对立方体切除标本的六个面各测一点，如图5插入所示。这些点随后墨水标记用于组织学对照。图5给出某标本六个位点的复合光谱。SORS光谱显示位点2、4、6在2 mm切缘内存在肿瘤细胞，经组织学证实（数据未示）。位点1、3、5则切缘无癌。
图5. 患者切除肿物六个不同解剖位置（from 1 to 6）的光谱。
五、结论与未来展望
本文证明SORS可用于检测位于正常乳腺组织下1–2 mm厚的乳腺肿瘤光谱特征。研究亦显示SORS可提供微米级分辨率，并检测生化模式细微差异的层次。能从样本深处如此小区域采集数据，为SORS在多种生物医学及其他应用中铺平道路。例如，治疗严重烧伤与创伤患者时，医生难以判断愈合阶段或感染存在，SORS可用于无创检测表面下变化。从组织不同深度获取拉曼光谱亦可能使皮肤、宫颈及结肠等其他癌症更易诊断。许多非生物应用亦可受益。药品执法局及国土安全部可利用SORS筛查未知物质，从多层获取关键信息，判断是否存在非法物质或化学战剂。这些仅为SORS潜在用途的一部分。从我们的术中肿瘤检测应用到药物领域的工作，SORS已开启超越表面的洞察之门。
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